Steven A. Rosenberg 博士的科学旅程故事

医学和科学中的真正创新是历史性的、独一无二的；每一次发生背后的故事都弥足珍贵。在 Molecular Medicine，设立了 Anthony Cerami 转化医学奖，以记录和保存这些历史。这些专著以提供关键早期见解的原始研究者本人的声音，叙述这些开创性事件。这些文章捕捉发现的本质，记录创造新研究领域并开启持续轨迹、最终影响疾病预防、诊断和治疗方式的思想的诞生。本卷中，Cerami 奖专著由 Steven A. Rosenberg 撰写，他是美国 Maryland 州 Bethesda 的 National Cancer Institute 外科主任。作为晚期癌症免疫疗法和基因疗法开发的先驱，这是 Steven A. Rosenberg 博士的科学旅程故事。

患者独特的临床病程可以为医生提供教科书中所没有的见解。Steven A. Rosenberg 在 Boston 的 Peter Bent Brigham Hospital 接受外科住院医师培训期间遇到的两名患者就是如此。1968 年夏天，Steven A. Rosenberg 被分配到 West Roxbury VA Hospital，当时遇到一名 63 岁退伍军人，主诉右上腹疼痛。诊断似乎是胆结石引起的胆囊炎症，需要手术切除胆囊。当 Steven A. Rosenberg 查看患者病历时，一个非同寻常的故事展开了。

十二年前，V.A. Hospital 的外科医生切除了患者三分之二的胃，其中包含一个大型侵袭性胃癌。手术记录显示，至少有三个肿瘤已扩散到肝脏以及多个淋巴结，且无法切除。送到病理学家的活检证实了癌症诊断。未给予进一步治疗。患者出院后不久再次就诊，恢复正常。五个月后，他回到医院，体重增加并已恢复工作。如今，12 年后，Steven A. Rosenberg 手术切除他的胆囊，却没有发现任何癌症残留痕迹。不知何故，这种癌症在没有任何治疗的情况下完全消退，这是医学中最罕见的事件之一。此前仅报道过少数胃癌发生这种消退的病例，Steven A. Rosenberg 最终发表了该病例（Rosenberg et al. 1972）。Steven A. Rosenberg 认为，患者的免疫系统很可能将他的癌症识别为异物并将其摧毁。

随后，Steven A. Rosenberg 开始了一项在其简单性上近乎天真的实验。Steven A. Rosenberg 想将这名患者的血液输给另一名癌症患者，看看他循环中的免疫淋巴细胞是否会影响另一名患者的癌症。Steven A. Rosenberg 在医院找到一名血型匹配的晚期胃癌患者，并获得许可，将那名发生自发性癌症消退患者的血液输给他。第二名患者没有改善，并很快因恶性肿瘤生长而死亡。但是，使用患者自身免疫淋巴细胞进行治疗的种子已经种下。

第二名患者的罕见病例也引起了 Steven A. Rosenberg 的兴趣。几年前，Brigham Hospital 的一名患者接受了来自一名车祸遇难者的移植肾。接受肾移植的患者很快发生转移性癌症，追溯发现来自移植肾，而该肾在不知情的情况下藏有癌症。患者正在接受免疫抑制药物以防止肾移植排斥。当免疫抑制药物停止后，肾脏被排斥并需要切除。远处部位的癌症沉积也随之消失。这名患者的病程强烈暗示，如果免疫刺激足够强——在本例中是对来自另一个体的异物组织的排斥——免疫反应能够排斥大型、血管化的转移性癌症。

因此，这两名患者提示了一条研究路径：尝试引导免疫系统摧毁正在生长的癌症。这段旅程占据了 Steven A. Rosenberg 此后 40 年的持续工作。

早期教育  

Steven A. Rosenberg 的职业道路在大约 6 岁时改变，从想成为牛仔变为一种强烈的、几乎带有精神性的渴望：成为一名医生。Steven A. Rosenberg 从父母那里听到的故事很可能是这一决定的根源。

Steven A. Rosenberg 的母亲和父亲出生在 Poland 的小镇。他们的家庭在第一次世界大战前针对犹太人的大屠杀中失去了一切，他们在战争期间躲在地窖里，依靠陌生人的善意生活，直到 1920 年代初分别来到美国。他们于 1927 年结婚，Steven A. Rosenberg 于 1940 年出生，当时他们住在 Bronx 的一套公寓里。Steven A. Rosenberg 记得第二次世界大战后的几个月，父母试图联系留在 Poland 的亲戚，却慢慢得知许多人在死亡集中营中死去。Steven A. Rosenberg 的父母经历过 Steven A. Rosenberg 几乎无法理解的邪恶。作为孩子，Steven A. Rosenberg 想停止他们的痛苦，停止所有人的痛苦。

Steven A. Rosenberg 相信，这段家族史最终影响了他选择从事癌症工作。癌症随机攻击所有年龄段的人，迫使受害者和他们的家人在其生长和扩散时无能为力地旁观。癌症谋杀无辜者。它是一场大屠杀。

Steven A. Rosenberg 的父亲和母亲都没有太多时间接受教育，他的哥哥和姐姐指导了他的教育。他们给 Steven A. Rosenberg 灌输了各种学科的书籍，他记得尤其被一本教他细胞可以在体外保持存活的书所激动。Steven A. Rosenberg 为诸如 Paul de Kruif 的 *Microbe Hunters*、Helen Clapesattle 的 *The Brothers Mayo*、Sinclair Lewis 的 *Arrowsmith* 和 Morton Thompson 的 *The Cry and the Covenant* 等书感到兴奋。Steven A. Rosenberg 的兄弟成为一名外科医生，并通过许多讨论点燃了 Steven A. Rosenberg 对实验室研究的兴趣。

Steven A. Rosenberg 对医学和科学的兴趣引导他进入 Bronx High School of Science，进入 Johns Hopkins 读大学和医学院，并于 1963 年在 Boston 开始外科住院医师培训。Steven A. Rosenberg 知道自己想照顾患者，但也想做旨在开发新疗法的研究。Steven A. Rosenberg 意识到，创新研究需要更深厚的基础科学背景。在外科实习 1 年后，Steven A. Rosenberg 获得许可离开住院医师项目，并花 4 年在 Harvard 完成生物物理学博士学位。前 2 年学习物理学、高等数学、物理化学和遗传学课程，随后 2 年进行实验室研究，研究人类细胞膜的蛋白质结构（Rosenberg and Guidotti 1968, 1969）。Steven A. Rosenberg 想要深厚的科学背景，以便能够借鉴不同科学领域的知识，并建立信心：只要努力并有一本好书，他就能理解科学的任何方面。Steven A. Rosenberg 不想因自己不知道的东西而受到威慑。

Steven A. Rosenberg 回到 Brigham 住院医师项目，但只待了 1 年，然后再次休假，在 Harvard 免疫学家 John David 的实验室做研究。在那里 1 年后（1970 年），Vietnam 战争正酣，Steven A. Rosenberg 加入 Public Health Service，成为 Maryland 州 Bethesda 的 National Cancer Institute 免疫学研究员。免疫学分部由 John Fahey 领导，随后由 William Terry 领导，后者给予 Steven A. Rosenberg 自由，去追求他在癌细胞膜上识别癌症抗原的兴趣。Steven A. Rosenberg 研究细胞膜上的唾液酸及其对免疫反应的影响（Rosenberg and Einstein 1972），但他在 NCI 度过的 2 年太短，无法取得实质性进展。Steven A. Rosenberg 知道自己想做能应用于患者的研究，因此需要额外的临床培训，于是回到 Boston 完成外科住院医师培训。

在住院医师培训的最后几个月，Brigham Hospital 外科主任 Francis Moore 向 Steven A. Rosenberg 提供了 Harvard 新 Dana Farber Cancer Center 外科主任的职位，以及 Harvard 的正式教职。在同意 Dana Farber 的邀请之前，Steven A. Rosenberg 接受了 National Cancer Institute 科学主任 Nathaniel Berlin 的面试。几个月后，他打电话告诉 Steven A. Rosenberg，现任 National Cancer Institute 外科主任即将辞职，并向 Steven A. Rosenberg 提供了该职位。Steven A. Rosenberg 的选择很明确。1974 年 6 月 30 日完成外科住院医师培训后的第二天，Steven A. Rosenberg 回到 Bethesda，担任 National Cancer Institute 外科分部主任，不仅负责临床项目，还拥有进行实验室研究的大量资源。

NIH 早期研究  

1974 年 7 月 1 日，当 Steven A. Rosenberg 来到 NIH 时，他决心研究人类生长中的癌症是否存在任何免疫反应，并可能由此产生有效的癌症免疫治疗。当时，整个肿瘤免疫学领域存在重大争议。癌症患者没有有效的免疫治疗，而且人类癌症是否表达能刺激免疫反应的抗原也存在相当大的怀疑。Steven A. Rosenberg 搬到 NCI 时，*British Journal of Cancer* 上的一篇文章引起了很多讨论，因为该文得出结论：在动物或人类中，从未显示对自发产生的癌症发生免疫反应，而小鼠移植瘤研究的结果与人类癌症关系不大（Hewitt et al. 1976）。*Cancer Research* 上发表的一句著名引语称：“要排斥右耳而保留左耳完整，与针对癌症进行免疫一样困难。”

当时，关于小鼠移植瘤免疫原性的重要信息来自多位研究者，包括 Alexander Fefer、Karl 和 Ingegerd Helstrom、George Klein、Richard Prehn、Lloyd Old 以及许多其他人。这些工作者证明，可以在小鼠中刺激防止移植癌生长的免疫反应，但对已形成的生长肿瘤的免疫反应的治疗影响知之甚少。当时，可能不存在针对人类自发癌症的免疫反应，这种担忧导致很少有研究者探索这一点。Steven A. Rosenberg 及其团队的初步研究致力于尝试测量患者对癌症的抗体反应，但没有成功。尽管人们怀疑 T 细胞反应性在排斥已形成组织方面更重要，但在体外研究淋巴细胞非常困难，因为它们从动物或人体取出后存活时间非常有限。由于在体外操纵 T 细胞很困难，Steven A. Rosenberg 随后绝望地开始另一个天真的实验，试图看看动物是否能针对人类癌症抗原免疫，并产生可用于治疗的 T 细胞。尽管这些异种细胞在体内存活时间可能很短，但也许它们能暂时影响肿瘤生长。一位名叫 M.O. Symes 的英国科学家发表过用人类肿瘤组织免疫猪，并利用这些猪淋巴细胞进行过继细胞转移免疫治疗的工作（Symes et al. 1973）。Steven A. Rosenberg 的好友 David Sachs 是一位杰出科学家，当时是 NIH 移植免疫学的主要研究者，他建立了一群在主要组织相容性（MHC）位点部分近交的迷你猪。Steven A. Rosenberg 将人类肿瘤植入这些猪，从引流淋巴结收获淋巴细胞，并将其转移给患者。实验室研究员 Norman Wolmark，后来成为著名外科肿瘤学家，进行了许多这些研究。在 Steven A. Rosenberg 及其团队治疗的六名患者中，没有因过继细胞转移出现并发症，但也没有抗肿瘤反应。Steven A. Rosenberg 强烈怀疑这不会奏效，但他渴望做点什么来推动进展。Steven A. Rosenberg 在实验室门上挂了一个牌子（套用 Louis Pasteur 的一句话）：“机会偏爱有准备的头脑，但仅当头脑在工作时。”

1976 年 9 月，当 Steven A. Rosenberg 研究小鼠模型和猪的工作时，Doris Morgan、Francis Ruscetti 和 Robert Gallo 在 *Science* 上发表了一篇论文，描述了一种由淋巴细胞产生的生长因子，可用于在实验室中培养健康的人类 T 淋巴细胞（Morgan et al. 1976）。这种 T 细胞生长因子后来被称为 interleukin-2（IL-2），对 Steven A. Rosenberg 想做的事具有巨大意义。读到这篇论文后不久，Steven A. Rosenberg 将实验室工作转向确定是否能在体外培养人类淋巴细胞，目标是指挥这些反应性对抗癌症。使用小鼠和人类淋巴细胞进行实验所需足量 IL-2 很困难，Steven A. Rosenberg 及其团队花了约 4 个月开发从小鼠脾脏，随后从人类脾脏和外周淋巴细胞生产 IL-2 的方法（Rosenberg et al. 1978a, b, 1980a; b; Yron et al. 1980; Strausser and Rosenberg 1978）。当时 Steven A. Rosenberg 的实验室很小，有两名博士后研究员，他们是来 NIH 接受培训的外科医生，还有两名技术员 Susan Schwartz 和 Paul Speiss，与 Steven A. Rosenberg 一起进行这些实验。通过微小增量推进，Steven A. Rosenberg 及其团队开发了从混合淋巴细胞培养物中生产小鼠和人类 IL-2 的强大方法，以及通过凝集素刺激淋巴细胞非特异性地诱导 T 细胞向培养基分泌 IL-2。逐渐地，他们纯化 IL-2 的能力提高，并开发了消除上清液中凝集素的方法，使培养物不会受到非特异性刺激（Spiess and Rosenberg 1981）。在与妻子 Alice 长时间讨论后，Steven A. Rosenberg 记得写下了利用 T 细胞进行免疫治疗的研究计划，并将其分为五项连续研究，如果成功，可能引导他们尝试利用 T 细胞进行人类免疫治疗。五个步骤如下：

1. Steven A. Rosenberg 及其团队能否在培养中从动物和人类生长 T 细胞，并使其保持特异性杀伤活性？  

2. 那些在培养中生长的反应性 T 细胞能否被输注到动物体内并保持杀伤功能？  

3. Steven A. Rosenberg 及其团队能否在荷瘤动物和人类中找到特异性攻击其癌症的细胞，生长这些细胞并在培养中保持其杀伤活性？  

4. 能否将这些癌症反应性 T 细胞输回动物体内，使其在体内保持杀伤活性并延缓或消除肿瘤生长？  

5. Steven A. Rosenberg 及其团队能否在人类中完成所有这些？

Steven A. Rosenberg 及其团队从非常基础的层面开始这些实验，首先使用混合淋巴细胞培养的简单模型，开发能够基于 MHC 抗原表达识别同种异体细胞的 T 细胞。他们表明，这些在体外产生的同种反应性 T 细胞在小鼠和人类中培养时都能维持其同种反应性（Rosenberg et al. 1978; Lotze et al. 1980a）。然后，他们建立了一个简化系统，通过探索这些转移的同种反应性细胞影响小鼠皮肤移植排斥的能力，来测试这些细胞在体内是否活跃。博士后研究员 Maury Rosenstein 能够证明，通过转移在体外产生和生长的特异性同种反应性细胞，可以加速皮肤移植排斥，从而证明这些细胞注射到动物体内后保留了特异性免疫反应性，并能排斥血管化组织（Rosenstein et al. 1981）。下一个挑战是尝试从荷瘤小鼠以及癌症患者中识别能够识别和攻击其癌症的细胞，并在体外生长这些细胞，看看它们是否保持抗肿瘤杀伤活性。

当这些技术研究进行时，Steven A. Rosenberg 及其团队尝试从生长肿瘤的基质中培养小鼠和人类的淋巴细胞。直觉上，最可能发现针对肿瘤反应性 T 细胞的位置似乎是肿瘤沉积本身。随后出现了一个有趣观察。当将肿瘤制成的单细胞悬液与 IL-2 一起培养时，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）生长，并慢慢清除培养物中所有无关细胞，包括肿瘤细胞（Yron et al. 1980; Lotze et al. 1981）。培养约 2 周后，可以获得纯淋巴细胞群体。外周血细胞在 IL-2 中培养短短 3 天后，也产生了在体外杀死培养肿瘤细胞的能力（Grimm et al. 1982）。IL-2 是众多淋巴因子之一，因此 Steven A. Rosenberg 及其团队将这些细胞命名为淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK），并基于这种体外杀伤活性，开始在小鼠中研究这些 LAK 细胞是否能在体内杀死肿瘤（Mule et al. 1984, 1985, 1986; Yang et al. 1985）。这些使用小鼠和人类 LAK 细胞的实验随后占据了 Steven A. Rosenberg 及其团队约 2 年时间，他们证明，通过静脉注射肿瘤细胞在小鼠肺部诱导的肿瘤，可以在肿瘤注射后长达 3 天输注 LAK 细胞成功消除。尽管比应该花的时间更长，他们证明，一旦肿瘤变大并血管化，LAK 细胞几乎没有影响，这最终成为他们研究中的一个错误方向。在这些研究过程中，1980 年，Steven A. Rosenberg 及其团队在人类中进行了首次 LAK 细胞研究，以研究其在体内的分布（Lotze et al. 1980b）。后来，他们给予用哺乳动物 IL-2 生长并用 Indium-111 标记的 LAK 细胞，以追踪 LAK 细胞在癌症患者体内的运输（Fisher et al. 1989; Griffith et al. 1989）。细胞迁移到肺部，并在接下来 48 小时内缓慢清除到肝脏和脾脏。未观察到抗肿瘤反应。

大约此时，Steven A. Rosenberg 及其团队开始使用移植的 FBL-3 淋巴瘤动物肿瘤模型，该模型由 University of Washington in Seattle 的 Alex Fefer 及其团队研究。FBL-3 癌症几乎变得像皮肤移植物一样外来，因此使 Steven A. Rosenberg 及其团队能够获得能够识别该肿瘤的小鼠淋巴细胞。实验室外科研究员 Timothy Eberlein 承担了该项目，以确定输注在体外生长的 FBL-3 反应性淋巴细胞是否能成功治疗患有生长 FBL-3 淋巴瘤的小鼠。University of Washington 的 Phil Greenberg 和与 Alex Fefer 合作的其他科学家已经优雅地证明，当这些淋巴细胞和肿瘤都腹腔注射并因此密切接触时，过继转移这些淋巴细胞可以介导该小鼠肿瘤消退（Cheever et al. 1981; Greenberg et al. 1981）。Steven A. Rosenberg 及其团队开始研究，在体外生长并全身静脉注射的同基因淋巴细胞是否也能介导肿瘤消退。这些实验向他们表明，血管化小鼠肿瘤可以被诱导消退，尽管所靶向的抗原很可能是同种异体的，因此只是真正癌症抗原的糟糕化身（Eberlein et al. 1982），如果这些抗原在人类中确实存在的话。

IL-2 给药作为获批人类癌症免疫治疗的起源  

当 Steven A. Rosenberg 及其团队尝试生长具有抗肿瘤活性的 T 淋巴细胞时，IL-2 供应是一个持续问题。他们从刺激的人类淋巴细胞以及在大桶中生长的 Jurkat 肿瘤系中生产 IL-2。到 1982 年 7 月，Steven A. Rosenberg 及其团队已实现天然产生 IL-2 的 1000 倍浓缩，将其注射到小鼠体内时，他们看到肿瘤生长适度减少（Rosenberg et al. 1985a）。因此，在实验动物中全身给予 IL-2 似乎可以刺激免疫反应，可能是由于在体内刺激了预先存在的特异性抗肿瘤 T 细胞。由于这些结果，他们想给患者 IL-2，但获得足够 IL-2 是个问题。他们几乎无法制造足够的纯化小鼠 IL-2 来进行最基本的小鼠实验。治疗患者将需要数百倍更大的量。

此时，显然必须转向其他来源，以获得研究其对患者影响所需的大量 IL-2。Dupont 的科学家 Richard Robb 从 Jurkat 白血病 IL-2 细胞系中纯化了人类 IL-2，比他们自己实验室获得的浓缩材料纯得多（Robb et al. 1983）。他们开始与 Dupont 讨论，到 1984 年 2 月初，Dupont 同意向他们提供 100 mg 纯化 IL-2，NCI 批准了一项临床方案，将 IL-2 作为研究性新药在临床实验中使用。1983 年 6 月，Dupont 的 Richard Robb 来到 Bethesda，交给他们六瓶含 75 mg 纯化 IL-2。领导许多早期人类实验的 Mike Lotze 随后在体外和小鼠中测试了这种 IL-2，以确定其安全性（Lotze et al. 1978; Donohue et al. 1984）。有趣的是，作为提供 IL-2 的条件，Dupont 要求他们保证只要其 IL-2“合适”，就继续使用他们的 IL-2，即使通过重组 DNA 技术出现了其他来源。Steven A. Rosenberg 及其团队拒绝同意该条件，Dupont 最终让步，同意提供纯化 IL-2。1983 年 7 月，他们开始了使用天然 IL-2 的首个 1 期试验。由于材料有限，他们无法大幅增加剂量，尽管他们治疗了 16 名晚期癌症患者，但未在任何患者中看到抗肿瘤活性。

因此，到 1984 年初，Steven A. Rosenberg 及其团队已治疗 26 名转移性癌症患者，所有人都出现癌症进展并死于疾病。这包括一名接受另一名治愈患者输血的受者、六名接受对人癌症组织致敏的猪淋巴细胞的患者、三名接受用哺乳动物 IL-2 产生的 LAK 细胞的患者，以及十六名接受 Dupont 天然哺乳动物 IL-2 治疗的患者，其中没有人显示任何临床反应迹象。但随着这些治疗推进，重组 IL-2 的出现即将为小鼠和人类实验提供更多 IL-2。

Steven A. Rosenberg 的 IL-2 工作基于他们的假设：刺激癌症患者的 T 淋巴细胞可能激活具有抗肿瘤活性的内源性淋巴细胞，从而摧毁生长中的肿瘤细胞。在这项努力中，这是一个既令人沮丧又令人兴奋的时期。到目前为止，他们未看到 IL-2 给药使肿瘤缩小，直到看到反应之前，完全不清楚他们的假设是否正确以及是否会发生。可用 IL-2 量一直有限，多家生物技术公司竞相克隆编码 IL-2 的基因，包括 Hoffman-La Roche、Amgen、Genentech、Dupont 和一家名为 Cetus Immune 的小型初创生物技术公司。日本科学家 Tadatsugu Taniguchi 于 1982 年首次从 Jurkat 细胞系中克隆了 IL-2 基因。他将该基因插入猴细胞，猴细胞开始产生大量 IL-2。他在科学会议上宣布了这项工作，随后不久在 *Nature* 上发表了 IL-2 基因序列（Taniguchi et al. 1983）。当 Steven A. Rosenberg 接到 Gary Fathman 的电话，邀请他去 Cetus 演讲他的工作时，他从未听说过 Cetus。1982 年 7 月 30 日，当 Steven A. Rosenberg 用部分纯化的哺乳动物 IL-2 进行实验时，他在 Cetus 演讲，希望刺激他们生产重组 IL-2，以便用于实验以及人类治疗。他于 1982 年 10 月 20 日再次访问他们，讨论他们正在进行的小鼠实验，这些实验显示 IL-2 对小鼠肿瘤生长有适度但直接的影响。随着他们的工作推进，Steven A. Rosenberg 与分子生物学家 David Mark 和蛋白质化学家 Kirston Koths 合作，他们是 Cetus 试图生产重组 IL-2 的主要科学家。David Mark 根据已知序列克隆了 IL-2 基因，并将其插入细菌，细菌开始产生大量 IL-2，占这些转化细菌产生的所有蛋白质的 10%（Wang et al. 1984）（Rosenberg et al. 1984）。6 月中旬，当 Cetus 举行年度务虚会总结公司工作结果时，Steven A. Rosenberg 作了一场演讲，旨在获得少量重组 IL-2 以开始在实验室工作。当时 Steven A. Rosenberg 不知道，Cetus 内部就是否向他提供少量珍贵的重组 IL-2 存在争论。在 Steven A. Rosenberg 演讲后于 Cetus 举行的一次先前会议上，宣布让房间里每个人知道他们即将展示的一切都是保密的。Steven A. Rosenberg 从未同意这种医学保密，在试图为绝望的癌症患者开发治疗时，这显得不体面。按照他们的要求，Steven A. Rosenberg 坐在侧室，无法听到他们的讨论。当 Steven A. Rosenberg 离开 Cetus 时，Kirston Koths 陪他走到一辆送他去机场的车旁。显然，Cetus 总裁 Jeff Price 决定向 Steven A. Rosenberg 提供一些材料。在 Steven A. Rosenberg 上车前，Kirston 伸手从衬衫口袋中掏出一个螺旋盖小瓶，里面装着不到一毫升的澄清液体，递给 Steven A. Rosenberg。这是刚从纯化柱下来的重组 IL-2。他们把 IL-2 小瓶从 Kirston 的口袋转移到 Steven A. Rosenberg 夹克的口袋，Steven A. Rosenberg 回到 NIH 并立即开始实验。他们的第一批实验表明，这种重组 IL-2 确实可以从小鼠和人类淋巴细胞中生长 T 细胞并产生 LAK 细胞。用于将这种材料送入培养物的移液器尖端留下的 IL-2，比他们以前从天然哺乳动物 IL-2 获得的可用量还多。Dupont IL-2 在体外以高达 1:4 的稀释度使用，但重组 IL-2 可以在 1:400,000 的稀释度下生长细胞。小鼠实验室实验似乎有希望，Steven A. Rosenberg 渴望开始在人类中测试 IL-2。

Michael Lotze 是一位聪明勤奋的外科住院医师，多年前在外科住院医师培训期间曾在 Steven A. Rosenberg 的实验室工作，并已回到外科分部担任高级职员。他与 Steven A. Rosenberg 密切合作，领导使用高度纯化天然 IL-2 的试验。1984 年 3 月，他们正在进行使用 Dupont 天然 IL-2 治疗患者的最后临床治疗。当这些试验进行时，Steven A. Rosenberg 已开始寻求 FDA 批准，将来自 Cetus 的重组材料用于临床试验，基于其在动物模型中的有效性，他们收到的剂量越来越大。他们于 1984 年 1 月 17 日获得 FDA 批准，距 Steven A. Rosenberg 拿到第一瓶重组 IL-2 仅 7 个月，随后开始人体实验。他们证明，IL-2 在人体中的半衰期只有 5 到 7 分钟，这表明他们可能需要非常大量的 IL-2，只有重组材料才能提供（Donohue and Rosenberg 1983）。他们的试验朝两个方向进行。他们要么单独给予重组 IL-2，要么给予用重组 IL-2 产生的 LAK 细胞。他们使用重组 IL-2 的 1 期试验中的首批患者于 1984 年 3 月开始。当时 NCI 主任 Vincent Devita 博士为他们提供了在 NCI 推进这项工作所需的空间和资源。他们用递增剂量的重组 IL-2 治疗了 23 名晚期癌症患者，并用重组 IL-2 产生的 LAK 细胞单独或与 IL-2 一起治疗了 27 名患者。没有患者出现肿瘤缩小，所有人随后都死于癌症。在这些 IL-2 给药试验中，他们开始看到后来被称为“细胞因子释放综合征”的毒性。患者出现高达 104 华氏度的高热和寒战，可通过给予 indomethacin 和 acetaminophen 等抗炎药缓解。短暂低血压和肾功能不全变得突出。他们根据 IL-2 在体内半衰期短的药代动力学研究继续增加 IL-2 剂量，但没有临床效果。因此，在治疗 76 名患者未成功后，Steven A. Rosenberg 感到有些绝望，想充分评估这种方法是否能刺激针对癌症的免疫反应，于是决定用人体能耐受的最大量重组 IL-2 治疗下一名患者，每 8 小时给予 IL-2，使血液水平持续维持在足以刺激淋巴细胞上三聚体 IL-2 受体的水平。

利用这种高度激进的 IL-2 治疗，他们治疗的第一名患者是一名 33 岁海军军官，患有黑色素瘤广泛皮下转移（Rosenberg et al. 1985b）。她首先来到 Maryland 州 Frederick 的 NCI 资助小组，接受了几种实验性治疗，包括单克隆抗体和 α 干扰素，均无效。Steven A. Rosenberg 及其团队从 1984 年 11 月 29 日开始，用 LAK 细胞以及每 8 小时高剂量静脉注射 IL-2 积极治疗 Linda。在这种激进的 IL-2 方案下，出现了显著毒性，包括毛细血管渗漏综合征，主要影响肺部，导致类似肺水肿的症状。他们以最大耐受量治疗 Linda，开始治疗后前 2 周，她因液体渗漏到身体软组织中而增加了 22 磅液体。她的症状严重到必须插管过夜以获得足够氧气，在最大医疗支持下，她慢慢恢复。到 Linda 出院时，他们看到她任何皮下肿瘤的大小都没有变化。1985 年 1 月 9 日，当她返回第一次随访时，情况仍然如此。他们活检了一个病灶。她第一次就诊回家几天后，他们收到病理学家的活检报告，指出“肿瘤细胞影的外观与患者先前诊断的恶性黑色素瘤一致……未发现存活肿瘤。”他们打电话告诉患者这一结果，尽管她告诉他们，她身上许多肿瘤都没有显示任何变化。一个月后她返回第二次随访时，她的肿瘤正在显著缩小，随后她所有转移性黑色素瘤完全消失。“Eureka”时刻在研究中最罕见，但对 Steven A. Rosenberg 来说这是其中之一。这是第一次，一种免疫学操作导致人类癌症消退。Linda 在 35 多年后仍然无病。他们用重组 IL-2 和 LAK 细胞治疗了 25 名患者，并于 1985 年在 *New England Journal of Medicine* 发表了研究结果（Rosenberg et al. 1985b）。Linda 和该试验中其他有反应的患者是首批从任何免疫治疗中出现可重复肿瘤缩小的患者。那是令人兴奋的时期，以下图片显示了这些早期反应的一些例子。*New England Journal* 文章引起了相当大的关注，许多其他人开始研究这种刺激机体免疫系统的方法。

与首名对 IL-2 给药有反应的患者在一起。她的转移性黑色素瘤于 1984 年完全消退，36 多年后仍无病。

对 IL-2 给药最早完全缓解的例子，最终导致首个癌症免疫治疗获得 FDA 批准（上排，黑色素瘤；下排，肾癌）。

尽管 Steven A. Rosenberg 知道他们对 IL-2 的发现会引起关注，但他对关于这种方法的全球报道爆发感到惊讶和尴尬。*Fortune* 杂志在 *New England Journal* 计划发表他们的文章前 10 天刊登了一篇文章，加剧了对这项工作的热情。该杂志刊登了一篇封面故事，标题是“癌症突破”。文章作者曾联系 Steven A. Rosenberg，但 Steven A. Rosenberg 拒绝在 *New England Journal of Medicine* 文章发表前与他交谈，正如 *Fortune* 杂志文章中所报道的那样。Steven A. Rosenberg 推测结果是由 Cetus 高管泄露的，尽管这从未被确定。此外，这种额外宣传之所以出现，是因为 Steven A. Rosenberg 在那年早些时候作为在 Bethesda Naval Hospital 切除 President Ronald Reagan 结肠癌的手术外科医生之一而获得了一些认可。宣传导致患者涌入，他们开始每周治疗多达四名患者。IL-2 给药在 *New England Journal* 报道的前 25 名患者中，介导了黑色素瘤和肾细胞癌患者的癌症消退。但毒性严重。在 ongoing 研究中，第 35 名接受 LAK 细胞加 IL-2 的患者是一名 24 岁转移性黑色素瘤男孩，这是首名死于该治疗的患者。随着他们治疗更多患者，他们开始学习如何管理毒性，并了解 IL-2 给药的极限。由于治疗引起的毒性，他们的方法受到了相当多的批评。尽管在对所有其他治疗难治的晚期转移性癌症患者中，他们的 IL-2 治疗相关死亡率在前 200 名患者中为 3–4%，但他们最终将这一毒性水平降至 0.5%（Kammula et al. 1998）。Linda Taylor 和许多后续患者接受了高剂量 bolus IL-2 以及 LAK 细胞，但这两种治疗的相对贡献尚不清楚。

正如癌症治疗新方法报告出现时常见的那样，他们的早期结果引起了相当大争议。Mayo Clinic 著名肿瘤学家 Charles Moertel 博士于 1986 年 12 月在 *Journal of the American Medical Association* 发表社论，认为在少数患者中的初步研究常常声称取得巨大成功，尽管这些治疗“随后被抛弃为无效”。他进一步认为，毒性和费用“没有由任何令人信服的真实净治疗获益证据来平衡。这种特定治疗方法似乎不值得在癌症患者的同情管理中进一步应用。”但其他人认识到这种首个有效免疫治疗的重要性。Philadelphia 的 Fox Chase Cancer Center 总裁 John Durant 为 *New England Journal of Medicine* 撰写社论，报道“……也许我们正处于成功癌症免疫治疗探索的开始的结束”，套用 Winston Churchill 在第二次世界大战北非战役胜利结束时所说的话。

在用 LAK 细胞和 IL-2 治疗患者，使 15–20% 的转移性黑色素瘤和肾癌患者出现客观癌症消退（约三分之一为完全消退）后，他们进行了一项前瞻性随机试验，其中 97 名转移性肾细胞癌患者和 54 名黑色素瘤患者接受 IL-2 联合或不联合 LAK 细胞治疗（Rosenberg et al. 1993）。他们在这两组患者中未看到反应率或生存差异，随后从治疗中剔除了 LAK 细胞。似乎很清楚，IL-2 给药介导了他们观察到的癌症消退，IL-2 的治疗影响是由于其刺激表达 IL-2 受体的淋巴细胞的能力。他们继续用高剂量 IL-2 治疗超过 1000 名转移性黑色素瘤或肾癌患者，在约 15% 的患者中取得客观反应，其中 1/3 为持久完全消退，这些后者患者中很少有在 25 年后随访时复发（Smith et al. 2008; Rosenberg et al. 1994a）。他们随后尝试了很多未能改善治疗的方法。他们进行了一项随机试验，102 名转移性黑色素瘤患者接受高剂量 IL-2 单独或 IL-2 加联合化疗，生存率无差异（Rosenberg et al. 1999）。他们外科分部高级职员 James Yang 博士是这项工作许多部分的密切合作伙伴，他在 156 名转移性肾癌患者中进行了一项三臂随机试验，评估高剂量 IL-2、较低剂量 IL-2 或每日皮下低剂量 IL-2（Yang et al. 2003）。这些试验强烈提示高剂量 IL-2 具有更优反应率，因此他们在后续试验中确定了这种高剂量方案。当时 National Cancer Institute 主任 Vincent DeVita 博士认识到这项工作的重要性，并支持一个外部研究者联盟来促进这些临床研究，最终在 1985 年至 1993 年间连续治疗了 270 名转移性黑色素瘤患者，使用高剂量 bolus IL-2，其反应率和生存与最初报道相似（Rosenberg et al. 1994a; Atkins et al. 1999）。在该试验中，6% 的转移性黑色素瘤患者所有疾病完全消退，10% 的患者经历部分癌症消退。这些结果以及他们先前关于高剂量 IL-2 给药有效性的试验提供了令人信服的证据，并最终导致 FDA 批准该治疗作为首个获批用于癌症患者的免疫治疗。FDA 于 1992 年批准高剂量 IL-2 用于转移性肾癌患者，1998 年批准用于黑色素瘤患者。

人类癌症细胞转移免疫治疗的起源  

当他们在 Linda Taylor 中看到对 IL-2 的首批反应时，他们开始实验以理解该现象背后的细胞机制。直觉上，具有推定特异性抗肿瘤活性的淋巴细胞（与 LAK 细胞的非特异性活性相反）最可能存在于肿瘤沉积的基质中。任何细胞转移免疫治疗建立的关键是识别能够特异性与癌症反应的免疫细胞。

他们开始实验，看看是否能从新鲜切除的肿瘤中存在的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中检测到特异性肿瘤反应性，并在 IL-2 中长时间培养。在 Steven A. Rosenberg 实验室工作的技术员 Paul Spiess 开始在实验室中连续移植的小鼠甲基胆蒽诱导肉瘤中进行研究。来自生长中小鼠肉瘤的细胞悬液在 IL-2 中培养数周，此时它们已从培养物中清除了肿瘤细胞。他们开始实验，用这些生长的 TIL 细胞治疗小鼠，并与几天内产生的 LAK 细胞进行比较。LAK 细胞对肺部大型血管化已形成结节几乎没有影响。然而，在 IL-2 中长时间体外生长的 TIL 有时仅特异性杀死其来源肿瘤，而不杀死其他肿瘤，因此提示 TIL 的特异性杀伤靶向独特的癌症相关抗原，这些抗原将肿瘤与正常组织区分开来。1986 年 7 月，大约在他们首次研究 TIL 18 个月后，他们在 *Science* 发表了关于该现象的第一篇论文（Rosenberg et al. 1986）。这篇论文的最后一句写道：“如本报告所述的小鼠肿瘤实验可以为结合这些治疗方法以开发用于治疗人类癌症的最佳组合免疫疗法提供理性基础。”

当这些小鼠实验进行时，实验室博士后研究员 Suzanne Topalian 和随后 Linda Muul 进行了实验，其中从人类黑色素瘤生长的 TIL 细胞只识别其来源肿瘤，而不识别其他患者的肿瘤（Topalian et al. 1989; Muul et al. 1987）。这些实验似乎证明人类癌症抗原确实存在。这是第二个 Eureka 时刻，促使他们即使尚未识别其分子性质，也追求 TIL 细胞在人类中的影响。他们迅速开始了一项初步研究，研究自体 TIL 对转移性黑色素瘤患者的影响。外科医生和实验室新研究员 Suzanne Topalian 开发了大量生长这些人类 TIL 的技术，他们获得机构审查委员会和 FDA 许可，利用相对少量的这些细胞治疗 12 名转移性癌症患者。在治疗患者中未看到临床抗肿瘤反应（Topalian et al. 1988）。随后他们加速这些研究，并建立了一个专门致力于大量生长 TIL 的独立实验室。在一项巨大努力中，他们开始在组织培养板中生长 TIL，然后在超过 70 个培养袋中生长多达 2000 亿淋巴细胞，用于患者输注，并与 IL-2 一起支持细胞在体内存活。16 名未接受过先前 IL-2 单独治疗的转移性黑色素瘤患者中，有 9 名显示部分或完全癌症消退，约为单独 IL-2 所见反应的两倍。5 名对先前 IL-2 治疗难治的患者中也有 2 名有反应。他们于 1988 年 12 月在 *New England Journal of Medicine* 发表了这前 20 名患者接受这种联合细胞治疗的结果（Rosenberg et al. 1988）。这项工作证明，T 淋巴细胞的作用至少部分负责介导晚期癌症患者的肿瘤消退。

癌症基因治疗的起源  

从 T 细胞转移工作开始，Steven A. Rosenberg 就考虑是否可能通过基因修饰 TIL 来表达肿瘤识别和摧毁癌细胞所必需的特性，从而改善其活性。他们首次对 TIL 进行基因工程的实验开始于 Steven A. Rosenberg 找到 NIH 科学家 Werner Green 之后，后者已识别编码 T 细胞上 IL-2 受体的基因。这些实验基于一个假设：通过基因创造表达大量 IL-2 受体的 T 细胞，可能使这些细胞对 IL-2 给药更敏感，从而更有效地摧毁肿瘤。尽管当时这似乎是一个合理想法，但他们未能使用当时使用的磷酸钙转染方法将 IL-2 受体基因导入 TIL。

尽管他们最早对淋巴细胞进行基因修饰的尝试未成功，Steven A. Rosenberg 开始与两位著名 NIH 科学家 French Anderson 和 Michael Blaese 博士合作，他们正在努力纠正患有 adenosine deaminase（ADA）突变儿童的基因缺陷，该突变使淋巴细胞无法正常运作。French 和 Mike 一直在研究逆转录病毒方法，作为将基因引入细胞的更有效方式，这似乎可能是一项重要技术进步，使他们能够为患者给药而基因修饰淋巴细胞。尽管 Steven A. Rosenberg 主要感兴趣的是将治疗基因插入 TIL，但从未有人将任何外源基因引入人类。经过多次讨论和数十次实验室会议讨论新数据，他们决定“破冰”使基因引入人类的一种方法是使用标记基因，使他们能够在 TIL 注射到体内后追踪它们。因此，他们提出了一项临床方案，插入编码酶 neomycin phosphotransferase 的细菌基因，使他们能够将该患者中给药的细胞与正常内源性淋巴细胞区分开来。与 French Anderson、Mike Blaese 和许多其他人密切合作，他们慢慢开始显示以高效率将这种细菌基因插入人类细胞并生长到大量。

1989 年，Steven A. Rosenberg 与 W. French Andersen 和 Michael Blaese 进行的许多讨论之一，当时他们计划并进行首次将外源基因引入人类。

关于将新基因插入人类细胞，存在相当多的监管和社会担忧，许多人提出激烈论点，认为这对患者、医疗科学家和公众风险太大。反对意见包括担心逆转录病毒虽被工程化使其不能复制但能插入转基因，可能重新组合内源性病毒并获得复制、感染其他细胞并可能致癌的特性。审查组的一些非专业成员提出精神担忧，认为篡改 DNA——即“上帝创造”的本质——是不道德的。

获得许可进行首次人类基因引入的审查过程令人精疲力竭且缓慢痛苦，他们向每个审查组提交数据以克服这些反对意见。尽管付出巨大努力，他们仍无法用逆转录病毒将基因插入小鼠淋巴细胞，这限制了他们在小鼠体内可进行的测试种类。他们制定了一项临床方案，并于 1988 年 6 月向 NIH 多个研究所的机构审查委员会小组提交提案，寻求批准这项人体实验。接着他们向处理重组 DNA 使用的 NIH 生物安全委员会提交计划，并于 7 月向重组 DNA 咨询委员会（RAC）的基因治疗小组委员会提交，该委员会多年前成立以确保任何重组 DNA 工作的安全。他们的陈述遭到每个审查组的强烈反对，每次他们做出修改以回应这些反对意见时，都需要先前小组重复审查。他们强调程序的安全性以及为防止潜在事故所做的所有修改。他们强调基因被插入体细胞，不能进入种系并影响后代。他们想治疗没有其他治疗选择且预期寿命为 3 个月或更短的晚期癌症患者。这项临床努力可能教会他们许多可用于开发和改善癌症治疗的东西。RAC 进行了激烈讨论，然后进行投票，方案最终以 16 比 5 获批。

RAC 是 NIH 主任的咨询委员会，当时主任是 James Wyngaardan 博士。几周后，1988 年 10 月 18 日，Wyngaardan 博士裁定，在这首次人类基因治疗尝试中，分裂投票是有问题的，他希望 RAC 决定一致。Steven A. Rosenberg 认为这是一个奇怪的决定，因为在他处理研究和临床努力时，即使在自己团队中，他几乎从未能在有争议问题上获得一致同意。随后他们向 RAC 提供了更多数据，12 月 9 日 RAC 以 13 比 0、1 票弃权批准了方案。一个月后，1989 年 1 月，他们准备继续，但在下一次 RAC 预定会议上，生物技术活动家 Jeremy Rifkin 宣布他提起诉讼以阻止实验，理由是审查过程不充分。会议一片混乱。许多残疾人挤满房间支持 Rifkin 的反对。他的论点情绪化，他说：“这是世界上首次将外源基因放入人体的实验。通过这个实验，我们开始了整个人类基因工程时代……如果我们不小心，我们会发现自己生活在一个残疾人、少数族裔和工人都被基因工程改造的世界……我们下次还会回来，再下次还会回来。”这使他们的临床试验又延迟了几个月，直到 NIH 解决了 Rifkin 的诉讼，使他们能够继续。1989 年 5 月 22 日，他们治疗了首名患者，注射其自身从肿瘤生长的 TIL 细胞，这些细胞经逆转录病毒转导了编码细菌酶 neomycin phosphotransferase 的基因。他们继续用基因修饰的自体细胞治疗 10 名晚期癌症患者，尽管没有人显示临床反应，但他们学到了大量关于这些基因修饰细胞运输和持续存在的信息，这些细胞可在细胞输注 2 个月后从肿瘤中回收。这项试验证明，尽管许多反对这种方法的人做出了可怕预测，但在人类中给予基因修饰人类细胞可以安全进行。一年后，1990 年 12 月，他们在 *New England Journal of Medicine* 发表了这些结果（Rosenberg et al. 1990）。

接下来 30 年（1990 至 2020）  

到 1990 年，他们已经确立，一种严格的免疫学操作，如 IL-2 给药，可以介导人类生长中转移性癌症的排斥。针对癌症患者的有效免疫治疗确实可能！它不再只是直觉或梦想。此外，他们已经证明，从生长中黑色素瘤沉积的基质中分离并生长的自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在体外表现出特异性肿瘤识别，输注这些细胞可以介导癌症消退。这强烈提示，这些由 IL-2 给药在体内刺激的 TIL 解释了 IL-2 的抗肿瘤影响。最后，他们已经证明，使用逆转录病毒转导淋巴细胞将外源基因引入患者是可行且安全的。尽管这项工作涉及引入一个细菌基因，使他们能够追踪给药淋巴细胞在体内的命运，但它开启了引入其他基因可能改善给药细胞抗癌特性的可能性。

这些早期发现是 Steven A. Rosenberg 接下来 30 年工作的基础，致力于改善和扩大细胞疗法用于治疗转移性癌症患者，使用自然产生的抗肿瘤 T 细胞或基因工程淋巴细胞。以下简要描述他们在这两条研究路线中的努力和进展。

在 Steven A. Rosenberg 团队所有成员（包括科学家、临床研究员、技术员、学生和护士）的每周实验室会议中（这张是 1998 年）。研究员展示他们正在进行的研究，以获得反馈并让所有人了解临床和实验室努力的最新情况。

2001 年外科分部高级成员。前排：Patrick Hwu、Suzanne L Topalian、Steven A. Rosenberg、H. Richard Alexander、James C. Yang；第二排：David S. Schrump、Dao Nguyen、David N. Danforth、Steven K. Libutti、David L. Bartlett、Douglas J. Schwartzentruber；第三排：Richard A. Morgan、Paul F. Robbins、Nicholas P. Restifo、John R. Wunderlich。

2006 年外科分部免疫治疗工作人员。前排：Ken-ichi Hanada、Nicholas P. Restifo、Maria R. Parkhurst、Mark E. Dudley。第二排：Luca Gattinoni、Paul F. Robbins、James C. Yang、Steven A. Rosenberg、Richard M. Sherry、Richard A. Morgan、John R. Wunderlich、Steve A. Feldman。插图：Marybeth S. Hughes、Giao Q. Phan。

使用自然产生的抗肿瘤淋巴细胞对癌症患者进行过继细胞治疗  

他们 1988 年发表的研究表明，给予从转移性黑色素瘤患者切除肿瘤结节中生长的自体 TIL，是细胞转移治疗可以介导人类转移性癌症消退的最清晰例子（Rosenberg et al. 1988）。在 20 名患者的报告之后，他们继续使用肿瘤浸润淋巴细胞加 IL-2 治疗 86 名转移性黑色素瘤患者（Rosenberg et al. 1994b）。这些患者的总体客观反应率为 34%，在接受或不接受低剂量 cyclophosphamide 或先前已通过 IL-2 进展的患者中，客观反应率无显著差异。在 29 名显示客观临床反应的患者中，只有 5 名完全缓解，发表时只有 2 名仍在持续，分别为 21 和 46 个月。客观部分缓解者的中位持续时间只有 4 个月。此外，输注细胞在循环中的持续存在时间很短。使用基因标记 TIL 的研究显示，1 周时循环中仅有 0.1% 的淋巴细胞代表转移细胞。Indium-111 标记的 TIL 显示转移淋巴细胞在肺部“滞留”长达 48 小时，随后细胞从肺部缓慢清除，主要到肝脏和脾脏（Fisher et al. 1989; Griffith et al. 1989）。

来自小鼠肿瘤模型 ACT 研究的新信息显示，在细胞转移前需要进行淋巴清除方案，以介导改善的抗肿瘤效果。他们接下来用非清髓性高剂量 cyclophosphamide（60 mg/kg × 2）和 fludarabine（25 mg/m² × 5）方案治疗患者，使循环淋巴细胞减少到接近零。CD8 淋巴细胞在 10 天内自然重建，CD4 细胞恢复慢得多（Dudley et al. 2002a, b）。这种非清髓性方案还导致白细胞和血小板减少，也在约 10 天内恢复。在最大淋巴清除时，细胞被给予 13 名患者，其中 6 名（46%）有客观临床反应，另外 4 名显示混合反应。5 名患者显示黑素细胞破坏迹象，包括 4 名白癜风患者和 1 名前葡萄膜炎患者。重要的是，转移细胞的持续存在显著增加，两名患者似乎发生转移细胞的克隆性再增殖（63% 和 97% 的循环 CD8 细胞来自输注袋）。使用这种淋巴清除方案代表了改善 ACT 的重要一步，并已成为过继细胞转移患者准备的主要方法（Dudley et al. 2003）。Nick Restifo 实验室的小鼠模型优雅实验定义了许多围绕淋巴清除有效性的机制。随后他们在一系列前瞻性初步试验中评估了通过在化疗方案中加入全身照射来增加淋巴清除。仅接受淋巴清除化疗的患者客观反应率为 49%，而接受额外 2 Gy 或 12 Gy 照射的患者分别为 52% 和 72%（Dudley et al. 2005, 2008）。使用 12 Gy 方案反应率似乎增加，后来促使他们在 101 名患者中进行前瞻性随机试验，一半接受 TIL 单独治疗，一半接受 TIL 加 12 Gy 全身放疗，结果在该试验中反应率或生存无差异（Goff et al. 2016）。这是又一个教训：非随机初步试验可能提供不可靠结果。他们于 2011 年发表了在 93 名转移性黑色素瘤患者中初步试验的分析（Rosenberg et al. 2011）。其中 20 名患者（22%）实现完全肿瘤消退，19 名在 3 年后仍有持续完全消退。主要由 Paul Robbins 进行的这些患者分析显示，若干因素与客观反应相关，包括输注细胞较长的端粒、输注的相对未分化 CD8+ CD27+ 细胞数量，以及输注后 1 个月输注细胞在循环中的持续存在（均 p2 < 0.001）。这些因素强烈提示，具有更高增殖能力的较未分化细胞是介导抗肿瘤反应的细胞，并与 Dr. Nicholas Restifo 实验室在动物模型中的类似发现一起，导致随后试验中大量尝试改善具有这些特性的细胞的给药。

当前对 192 名连续黑色素瘤患者的分析显示，这些患者接受从黑色素瘤碎片生长并扩增到大量后回输的 TIL，在 192 名 checkpoint 初治患者中客观反应率为 56%，包括 48 名（25%）完全消退和 9 名（5%）部分消退持续超过 5 年。在 48 名完全消退患者中，只有 2 名曾复发，中位潜在随访超过 7 年，只有 2 名患者需要第二次治疗。在 34 名先前接受抗 PD1 checkpoint 抑制剂治疗并进展的患者中，使用 TIL 的 ACT 反应率降至 24%；解释这种下降的原因正在研究中。

具有特异性识别黑色素瘤的 T 细胞群体使 Steven A. Rosenberg 及其团队能够使用这些细胞通过表达克隆技术尝试克隆人类肿瘤抗原。这种费力技术最初由 Belgium 的 Thierry Boon 成功用于识别癌睾丸抗原，随后被用于识别黑色素瘤和其他实体癌患者中 T 细胞识别的多种共享和突变抗原（Bruggen et al. 1991）。

尽管黑色素瘤似乎对使用从切除黑色素瘤肿瘤沉积中生长的未选择细胞进行过继细胞治疗敏感，但这种方法在其他组织学类型中未导致抗肿瘤反应（除了罕见地在 HPV 诱导癌症中（Stevanovic et al. 2015）），并促使大量努力确定代表美国约 90% 癌症死亡的实体上皮癌是否确实表达人类 T 细胞识别的癌症抗原。

黑色素瘤患者中 TIL 介导的癌症消退很少涉及正常细胞破坏。这一线索以及通过 cDNA 表达克隆技术发现的少量突变抗原，促使他们假设癌症突变是有效 TIL 最可能的靶点，并促使他们在 2013 年开发一种新的高通量筛选方法，以识别癌细胞中癌症突变产物的潜在免疫原性（Lu et al. 2014; Robbins et al. 2013）。新的筛选方法涉及对肿瘤进行全外显子组测序，以识别患者癌症中表达的所有突变基因。然后他们通过在患者抗原呈递细胞上表达所有突变 T 细胞表位来评估它们。该测定具有多重优势，因为呈递在患者所有 MHC 分子上的所有非同义癌症突变都在单一测定中被询问。在对 76 名转移性黑色素瘤患者的更新研究中，识别出 180 个免疫原性表位，占所有突变的 1.3%。出乎意料的是，所有被识别的新抗原都是独特的，患者之间没有共享。在 75 名各种转移性胃肠道癌症患者中，62 名（83%）含有识别总共 124 个癌症突变的 T 细胞，除一个（KRAS G12D）外全部独特（Parkhurst et al. 2019）。这些研究现已在 195 名常见上皮癌患者中进行。大约 80% 的所有癌症组织学患者含有能够识别其癌症中呈递和表达的独特癌症突变的 T 细胞。在这 195 名患者中识别的 363 个新抗原中，362 个抗原是患者个体独特的，只有 2 名患者识别相同的共享 KRAS 突变，且在同一 Cw*0802 MHC 限制元件上。因此，绝大多数人类癌症似乎具有免疫原性，并且可以产生识别这些独特癌症决定簇的 T 细胞。

在最近的研究中，Steven A. Rosenberg 及其团队正在应用这些信息来识别对癌症突变产物具有独特反应性的细胞，并使用高度选择的 TIL 治疗这些常见上皮癌患者。首名接受识别胆管癌患者独特癌症突变（ERBB2IP）的高度选择细胞群治疗的患者，出现了显著持久的肿瘤消退（Tran et al. 2014）。他们随后报道了结肠癌（Tran et al. 2016）和乳腺癌（Zacharakis et al. 2018）患者的肿瘤消退，表明确实可能使用靶向独特癌症抗原的过继细胞治疗在多种癌症类型中介导肿瘤反应。

这些研究提示，识别随机体细胞突变是大多数实体癌免疫治疗中癌症消退的“最终共同”通路（Tran et al. 2017）。此外，似乎任何细胞内蛋白如果发生突变并在细胞内加工成能结合自体 MHC 的肽，都可能成为癌症抗原。这既是好消息也是坏消息。大多数癌症患者可能符合这种治疗资格，因为几乎所有癌症都含有突变。此外，这种治疗必须高度个体化，因为个体患者必须用识别其癌症中独特突变的 T 细胞治疗。因此治疗将高度复杂。这些研究正在进入肿瘤学中现存最大问题：为转移性实体上皮癌患者开发癌症治疗，这些癌症导致全球 90% 的癌症死亡。当 Steven A. Rosenberg 在 2021 年撰写这篇综述时，这一挑战占据了他全部的研究努力。

使用人类淋巴细胞基因修饰改善癌症患者过继细胞治疗的抗肿瘤活性  

当上述自然产生的抗肿瘤淋巴细胞研究进行时，他们正在研究基因修饰淋巴细胞以改善其抗肿瘤效果的方法。这些研究最初受限于基因转染人类淋巴细胞的低效率。他们和其他人加强努力，改进可用于插入这些基因的逆转录病毒载体。在 Steven A. Rosenberg 的团队中，这些初步研究由 Richard Morgan 领导，他于 2001 年加入 Steven A. Rosenberg 的实验室，以及 Dr. Patrick Hwu，他于 1990 年作为 National Cancer Institute 医学肿瘤学培训的一部分来到 Steven A. Rosenberg 的实验室。

肿瘤坏死因子（TNF）在小鼠模型中被描述为高度活跃的抗癌分子，似乎会损害快速生长肿瘤的血管系统。他们首先尝试使用自体 TIL 作为载体，将高浓度 TNF 递送到肿瘤沉积。TNF 基因被转导到淋巴细胞中，分泌的 TNF 水平比用该基因转导的肿瘤细胞系低 30 倍（Hwu et al. 1993a）。尽管肿瘤坏死因子分泌低，他们在几名患者中尝试了这种治疗。1992 年，他们治疗了一名 52 岁转移性黑色素瘤女性，她在使用未转导 TIL 随后多剂 IL-2 以在体内保持这些细胞存活后进展（Rosenberg 1992）。他们从她全身许多皮下病灶之一生长 TIL，用编码 TNF 的基因转导淋巴细胞，并在没有 IL-2 给药的情况下每周两次注射递增剂量的这些 TNF 基因修饰 TIL。多个黑色素瘤结节消退并最终消失，患者无病存活数十年。肿瘤坏死因子的血流动力学影响令人担忧，尽管这些患者没有毒性，可能是因为产生的 TNF 量非常低。尚不完全清楚 TNF 是否在肿瘤缩小中起作用，因为一些患者可能对第二次自然产生 TIL 治疗有反应。能够成功用这种 T 细胞功能修饰治疗患者，是继续努力基因修饰淋巴细胞以改善抗肿瘤活性的刺激。

大约此时，Steven A. Rosenberg 听到 Israel 的 Weizman Institute 的 Dr. Zelig Eshhar 的讲座，他开发了一种通过构建嵌合抗原受体（CAR）改变淋巴细胞功能的技术，CAR 含有由柔性 linker 连接的抗体重链和轻链可变区，并连接到 T 细胞受体恒定区（Eshhar et al. 1993）。对这种潜在技术应用于治疗癌症感到兴奋，Steven A. Rosenberg 迅速邀请 Dr. Eshhar 从 Weizmann Institute 休假来到 National Cancer Institute 的实验室，以便他们合作将这种方法应用于患者癌症治疗。

如果他们能利用识别癌症抗原的单克隆抗体产生 CAR 并将其插入淋巴细胞，就可能创造不受 MHC 限制这一传统 T 细胞受体特征的肿瘤反应性淋巴细胞。Dr. Eshhar 于 1990 年来到 Steven A. Rosenberg 的实验室，与 Patrick Hwu 和实验室其他成员并肩工作。他们首先构建靶向 38-kD 叶酸结合蛋白（FBP）的 CAR，这是一种在大多数人类卵巢癌中过表达的分子。Patrick Hwu 表明，这些 CAR 修饰的 TIL 可以在体外实验中被成功重定向以特异性靶向 FBP（Hwu et al. 1993a, b）。腹腔植入人类卵巢癌细胞的裸鼠接受抗 FBP CAR 转导淋巴细胞治疗后，与未治疗小鼠相比生存增加（Hwu et al. 1995）。在第二个模型中，通过 IV 注射转导 FBP 的甲基胆蒽诱导肉瘤诱导肺部肿瘤的小鼠，可以通过全身注射这些表达 CAR 的细胞治疗。随后在 16 名晚期癌症患者中进行了初步临床试验。这些早期研究表明，可以用这些 CAR T 细胞治疗患者，尽管未看到抗肿瘤反应。与 Patrick Hwu 合作的 Dr. Michael Kershaw 于 2006 年发表了这一经验，这刺激了对使用 CAR 进行抗癌治疗的兴趣（Kershaw et al. 2006）。

使用 CAR 治疗实体癌的一个主要问题是缺乏能够选择性识别癌症而非正常细胞的单克隆抗体。他们在 CAR 和 TCR 方面的经验教会他们，当受到淋巴细胞攻击时，正常细胞可能像癌细胞一样迅速被摧毁，这可能导致患者严重毒性甚至死亡。他们通过用靶向正常 ERBB2 的 T 细胞治疗一名患者（Morgan et al. 2010），以及用靶向 MAGE-A3 的 TCR 治疗两名患者（Morgan et al. 2013），痛苦地学到了这一教训。这些与治疗相关的死亡对 Steven A. Rosenberg 和整个团队造成了创伤。这让他想起给患者手术而患者死在手术台上的经历。毫无疑问谁应对悲剧负责。

当 CAR T 细胞这项工作进行时，他们越来越强调使用来自 TIL 的传统 α/β T 细胞受体，这些受体可以识别在细胞表面 MHC 分子上以肽呈递的细胞内癌症抗原。使用表达克隆技术，Yutaka Kawakami 使用他们来自黑色素瘤患者临床试验的 TIL，识别了两种黑色素瘤/黑素细胞分化抗原，称为 MART-1 和 gp100（Kawakami et al. 1994a, b）。

编码识别 MART-1 抗原的 TCR 的基因，从一名在 TIL 转移后显示转移性黑色素瘤接近完全消退患者的黑色素瘤 TIL 中分离。他们在 15 名转移性黑色素瘤患者中进行了初步临床试验，使用转导了编码 MART-1 反应性 TCR 基因的外周血淋巴细胞（Morgan et al. 2006）。在输注后至少 2 个月，观察到持久植入水平超过外周血 T 细胞的 10%，在一些患者中，工程化细胞在一年后仍在循环中发现。两名患者显示转移性黑色素瘤持续客观消退，其中一名患者腋窝肿块完全消退，肝脏转移灶减少 89%，持续治疗后 21 个月。第二名患者肺门肿块完全消退，10 多年后仍临床无病。这项临床试验代表了基因修饰表达 T 细胞受体的细胞能够介导人类癌症消退的首个例子（Morgan et al. 2006）。Laura Johnson 扩展了这些研究，识别出一种靶向 MART-1 的非常高亲和力 T 细胞受体，随后他们用其治疗 20 名转移性黑色素瘤患者，另有 16 名患者接受由 Nicholas Restifo 实验室开发的识别 gp100 的小鼠 T 细胞受体转导的自体淋巴细胞（Johnson et al. 2009）。这两项试验的客观反应率分别为 30% 和 19%。然而，使用这些高亲和力 T 细胞受体，一些患者出现严重听觉和眼部毒性，可能是由于眼睛和耳朵中的黑素细胞也被靶向。通过停止治疗并给予局部类固醇，患者恢复到正常基线功能，无残留缺陷，但这些毒性促使他们停止靶向这些正常黑素细胞抗原的临床试验。这些研究随后由外科分部的 Paul Robbins 扩展，证明靶向 NYESO-1 癌睾丸抗原的 T 细胞受体也可以介导患者肿瘤消退（Robbins et al. 2015）。如前节所述，他们现在可以在大多数常见上皮癌患者中识别癌症抗原及其同源 T 细胞受体，并正在尝试将这些受体引入自体淋巴细胞用于治疗。

这些早期研究表明，基因修饰淋巴细胞可以介导肿瘤消退，并在现代血液和实体癌基因治疗发展中发挥了形成性作用。

在他们使用 T 细胞受体转导治疗实体瘤工作的几个月内，他们回到使用靶向 CD19 分子的嵌合抗原受体，CD19 存在于大多数恶性 B 细胞以及成熟 B 细胞和 B 细胞前体上。Memorial Sloan Kettering 的 Michael Sadelain 实验室早期实验证明，表达抗 CD19 CAR 的淋巴细胞可以在体外杀死 CD19+ 原代白血病细胞，并在小鼠异种移植模型中消除 CD19 靶细胞（Brentjens et al. 2003）。此外，有数据提示向 CAR 添加 CD28 或 41BB 等共刺激部分可以增强抗原特异性细胞因子产生和增殖（Sadelain et al. 2013）。这些将 CD19 作为靶点的研究导致对使用这种细胞转移方法治疗 B 细胞恶性肿瘤患者的兴趣。

2007 年 3 月，National Cancer Institute 的医学肿瘤学/血液学研究员 James Kochenderfer 找到 Steven A. Rosenberg，提议利用他们正在进行的 T 细胞受体转移和 CAR T 细胞转移工作，靶向 CD19 以治疗晚期淋巴瘤患者。Jim 加入 Steven A. Rosenberg 的实验室，构建了两种 CAR，含有源自 FMC63 小鼠杂交瘤的小鼠抗人 CD19 抗体链。这些逆转录病毒载体编码单链抗体、CD28 共刺激分子的一部分以及 TCR zeta 链分子的胞质成分，位于 MSGV 逆转录病毒骨架中。他选择了一种在转导到 CD8+ 和 CD4+ T 细胞中时体外效力最强的 CAR，并显示对表达 CD19 的肿瘤细胞具有高度特异性活性，通过裂解和细胞因子产生衡量。在同基因小鼠淋巴瘤模型中，如果先进行淋巴清除全身照射，输注抗 CD19 CAR T 细胞可以根除肿瘤（Kochenderfer et al. 2010a）。2009 年 5 月，在大量体外和小鼠研究之后，他们用转导了抗 CD19 CAR 构建体的自体外周淋巴细胞治疗了首名患者（Kochenderfer et al. 2010b）。这名首名患者是一名 48 岁男性，患有非霍奇金淋巴瘤，此前接受过四种不同方案，包括激进联合化疗。患者淋巴结、纵隔和腹部有广泛大块疾病，在两个周期的 CD19 CAR T 细胞治疗后，他经历完全消退，10 多年后仍在持续。这份 2010 年发表的报告以及他们正在进行的、显示前七名患者中六名客观反应（包括五名完全缓解）的研究，激起了对这种方法的相当大兴趣（Kochenderfer et al. 2010b, 2011）。在他们首次发表 10 个月后，University of Pennsylvania 团队报道使用抗 CD-19 T 细胞治疗三名急性淋巴细胞白血病儿童出现抗肿瘤反应（Porter et al. 2011）。他们的团队和其他人继续治疗大量患者，证实这种方法能够介导晚期弥漫性大 B 细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病患者消退（Kochenderfer et al. 2017）。

a 首名对治疗有反应患者（2009 年）的 CT 扫描，该患者接受过继转移基因工程表达靶向 CD19 嵌合抗原受体的自体淋巴细胞（左，淋巴瘤负荷用箭头显示）；右，癌症完全消退，10 多年后仍在持续。b 治疗后 10 年，与首名患者在诊所。

当他们报道这些抗 CD-19 CAR T 细胞治疗的显著反应时，Steven A. Rosenberg 于 2011 年接到 Arie Belldegrun 的联系。Arie Belldegrun 是一名前研究员，当时是 UCLA 泌尿外科教授，25 年前曾在 Steven A. Rosenberg 的实验室工作。Arie 有一个将这种方法商业化以治疗血液癌症的愿景。2012 年，外科分部 NCI 与 Dr. Belldegrun 创立的 Kite Pharma 签署了合作研究与开发协议（CRADA）。他们将技术转移给 Kite，并与其密切合作开发适用于良好生产规范的封闭细胞生产系统。外科分部的临床研究，经 Kite Pharma 后续多机构研究确认，导致约 83% 的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤患者客观反应，58% 完全持久缓解（Cappell et al. 2020; Neelapu et al. 2017）。Kite Pharma 和 Novartis（后者与 University of Pennsylvania 团队合作进行试验）均于 2017 年获得 FDA 批准，分别将 CD19 CAR 推向市场，用于治疗弥漫性大 B 细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。同月，Kite 以 119 亿美元出售给 Gilead Sciences。抗 CD19 CAR 研究现已在全美国、欧洲和 Israel 的患者中广泛使用。全球超过 200 家公司正在努力开发基于细胞的疗法。

结论  

当 Steven A. Rosenberg 于 1974 年 7 月 1 日来到 National Cancer Institute 担任外科分部主任（他连续担任该职位 46 年）时，关于免疫系统与人类生长中癌症之间可能关系，几乎一无所知。在随后的四十年中，许多研究小组学到了很多，特别是在细胞转移治疗和抑制 CTLA-4 和 PD-1 的 checkpoint 调节剂（CPM）领域。尽管他们曾短暂研究 CPM，并于 2003 年报道了使用抗 CTLA-4 的 CPM 给药的首批人类临床反应（Phan et al. 2003），但这种方法的开创性背景开发和广泛临床应用是由其他人完成的（Sharma and Allison 2015），Steven A. Rosenberg 在本专著中未讨论该主题。在这篇简要综述中，Steven A. Rosenberg 试图呈现他在 National Cancer Institute 实验室开发有效细胞免疫疗法治疗癌症患者的努力的起点和进展。

在 NCI 的前 10 年，Steven A. Rosenberg 进行了癌症免疫反应的实验室和小动物研究，尽管他们在成功将这些发现应用于癌症患者治疗方面没有取得进展。在此期间，他们使用转移具有非特异性肿瘤反应性的淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞，或给予哺乳动物和后来重组 interleukin-2 作为非特异性免疫刺激剂，治疗了 76 名患者，未在这些患者中看到临床反应。直到 1985 年，使用基于药代动力学研究的高剂量和适当时间表输注重组 interleukin-2，他们治疗了一名转移性黑色素瘤患者，其疾病完全消失（现已持续 36 多年）。其他反应很快出现，他们继续用 IL-2 治疗超过 600 名癌症患者，这些结果在其最终获批为首个 FDA 批准的癌症免疫治疗中发挥了重要作用。这些 IL-2 研究首次表明，一种免疫学操作可以介导人类癌症消退。

他们的工作继续解释这些 IL-2 介导反应的机制，并于 1988 年证明，从生长肿瘤基质中获得的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），在 IL-2 中体外扩增并给予患者，可以介导肿瘤消退。这项工作最终导致转移性黑色素瘤患者客观反应率达到 56%，包括 22% 持久完全缓解。这些不断发展的结果是他们接下来 30 年努力使用淋巴细胞作为癌症治疗“活药物”的基础。

他们进行了一系列利用 T 细胞转移的研究，包括开发基因修饰淋巴细胞，使其具有改善抗癌反应性的特性，这些研究最终使他们能够将靶向 CD19 的嵌合抗原受体（CAR）转导到自体淋巴细胞中，用于治疗侵袭性淋巴瘤患者，这是 FDA 批准的首个癌症细胞疗法。

在这项工作过程中，他们研究了许多在患者中无效并导致进展大幅延迟的方法。他们对非特异性淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞的研究因其对小 mouse 肿瘤的影响而吸引他们，但其在前瞻性随机试验中缺乏有效性，最终促使他们放弃使用。回想起来，他们追求它的时间比应该更长。他们从早期靶向正常黑色素瘤/黑素细胞抗原的研究中学到了很多，但也痛苦地了解到，靶向这些正常未突变抗原（包括 Her-2、CEA 和 MAGE-A3）可能导致正常组织破坏和患者严重毒性，包括死亡。他们开发了测定人类 T 细胞识别抗原分子性质的方法，最终促使他们证明，针对癌症突变产物的免疫反应性可能是大多数（如果不是全部）癌症患者免疫治疗的“最终共同通路”，从而避免对正常组织的反应性。

在细胞转移免疫治疗研究过程中，他们花了相当多时间尝试开发治疗性癌症疫苗。他们用共享和独特肿瘤抗原的各种癌症疫苗治疗了 428 名患者，但没有成功（Rosenberg et al. 2004），迄今为止，没有任何直接免疫策略在癌症治疗中有效。

现在癌症免疫治疗面临的主要挑战是为导致所有癌症死亡 90% 的转移性实体上皮癌患者开发有效治疗。在过去 5 到 6 年中，Steven A. Rosenberg 将其努力全部投入这一目标。他们已经证明，约 80% 的常见上皮癌患者含有识别自体癌症中独特突变产物的 T 细胞，靶向这些突变有时可以导致癌症消退。他们现在已经在多种常见癌症（如结肠癌、乳腺癌和宫颈癌）的选择性患者中看到反应，当前努力正在进一步改进这种方法。

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https://link.springer.com/article/10.1186/s10020-021-00321-3